تدور قصة Assassin's Creed Brotherhood حول إزيو أوديتوري دا فيرنزي في روما، حيث يسعى لإعادة بناء فرع جماعة القتلة وتدمير عائلة بورجيا المتنافسة بقيادة تشيزاري بورجيا، وذلك بعد تعرض مدينته مونتيريجيوني للهجوم وسرقة تفاحة عدن منه. بالتوازي، يواصل ديزموند مايلز استكشاف ذكريات أسلافه عبر جهاز الأنيموس بحثًا عن مفتاح لمواجهة خطر انقراض البشرية في عام 2012